引言

GSPT1（G1 to S phase transition 1），作為人類(lèi)基因組中的一個(gè)基因，編碼了一種重要的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的翻譯終止過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)和藥物研發(fā)的快速發(fā)展，GSPT1逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

GSPT1是一種翻譯終止因子，它通過(guò)結(jié)合eRF1（真核翻譯釋放因子1）來(lái)識(shí)別mRNA上的終止密碼子，從而促使翻譯完成的蛋白質(zhì)從核糖體中分離出來(lái)。這一過(guò)程是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的重要環(huán)節(jié)，對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能至關(guān)重要。

在腫瘤細(xì)胞中，GSPT1的表達(dá)水平往往發(fā)生異常變化。下調(diào)GSPT1可以導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白的異常表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或誘導(dǎo)其凋亡。這一特性使得GSPT1成為腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

新型GSPT1降解劑的研發(fā)

為了更有效地利用GSPT1作為治療靶點(diǎn)，科學(xué)家們致力于開(kāi)發(fā)能夠特異性降解GSPT1的小分子藥物。其中，PROTAC（Proteolysis-Targeting Chimeras）技術(shù)和MG（Molecular Glue）技術(shù)成為了研究的熱點(diǎn)。

PROTAC技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)一種特殊的分子，使其能夠同時(shí)結(jié)合靶蛋白（如GSPT1）和E3泛素連接酶，從而促進(jìn)靶蛋白的泛素化和蛋白酶體降解。而MG技術(shù)則利用小分子化合物觸發(fā)靶蛋白與E3泛素連接酶之間的緊密蛋白相互作用，實(shí)現(xiàn)靶蛋白的降解。

案例分享

研究者們基于先前的發(fā)現(xiàn)，即GSPT1的耗竭可以導(dǎo)致原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期延遲，進(jìn)一步研究GSPT1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中的潛在作用。

研究方法：

1.使用CC-885（一種能夠通過(guò)與CRBN結(jié)合促進(jìn)GSPT1降解的藥物）處理攜帶U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的裸鼠，觀(guān)察其生存期的變化。CC-885 治療延長(zhǎng)移植 U87 細(xì)胞的裸鼠存活時(shí)間。將 1 × 106 個(gè)表達(dá) iRFP720 的 U87 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞移植到裸鼠的腦內(nèi)。將 50 或 100 mg/kg 的 CC-885 溶解在 DMSO 中，并將等量的 DMSO（作為對(duì)照）在第 16、18、20 和 22 天（共 4 次）腹膜內(nèi)注射給裸鼠。

移植、CC-885 給藥和使用體內(nèi)成像系統(tǒng) (IVIS) 評(píng)估腫瘤大小的圖表。B 在第 15 天和第 24 天使用 IVIS 評(píng)估腫瘤大小。C 繪制了從移植到死亡的存活期（x 軸）和存活率（y 軸）。n = 5。**P = 0.0021（DMSO vs. 50 mg/kg CC-885），**P = 0.0021（DMSO vs. 100 mg/kg CC-885），和**P = 0.0044（50 vs. 100 mg/kg CC-885），采用 Kaplan–Meier 方法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。D 在第 24 天使用 GSPT1 抗體通過(guò)免疫印跡 [n = 3（50 mg/kg CC-885）、2（100 mg/kg CC-885）和 4（DMSO）] 評(píng)估 CC885 對(duì)腦腫瘤中 GSPT1 表達(dá)水平的影響。通過(guò)使用 GAPDH抗體的免疫印跡確認(rèn)蛋白質(zhì)的比較負(fù)載。E 通過(guò)免疫染色評(píng)估 CC-885 對(duì)腦腫瘤的影響。移植的腦腫瘤（WT、經(jīng) CC-885 處理的 WT）在第 24 天被移除、固定并嵌入石蠟中。使用 GSPT1、Ki-67 和磷-ERK1/2 抗體對(duì)樣品進(jìn)行蘇木精-伊紅 (HE) 染色和免疫染色（蘇木精復(fù)染）。n = 5；比例尺：100 μm（HE、GSPT1 和 pERK）和 50 μm（Ki-67）。使用 ImageJ 軟件測(cè)量腦腫瘤中的 F Ki67 免疫染色指數(shù)，并繪制 Ki67 指數(shù)。****P < 0.0001，通過(guò)單因素方差分析和 Tukey 事后檢驗(yàn)。

2.制備GSPT1基因敲除（KO）的U87細(xì)胞和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FLAG標(biāo)記GSPT1的GSPT1-KO U87細(xì)胞（Rescued GSPT1-KO），并將其移植到裸鼠腦中，比較它們與野生型（WT）U87細(xì)胞的生存期。

移植 Rescued  GSPT1-KO  U87 細(xì)胞的裸鼠的延長(zhǎng)存活期被取消。生成了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)  GSPT1-FLAG的GSPT1-KO  (A-7)  U87  膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。A.通過(guò)使用 GSPT1 抗體的免疫印跡法證實(shí)Rescued  GSPT1 U87  細(xì)胞中  GSPT1-FLAG  的表達(dá)與 WT  U87  細(xì)胞中 GSPT1-FLAG  的表達(dá)相當(dāng)。通過(guò)使用  β-actin  抗體的免疫印跡法證實(shí)了蛋白質(zhì)的比較負(fù)載。B  評(píng)估并繪制了三種細(xì)胞系的生長(zhǎng)率（WT和  Rescued  GSPT1-KO  中的 n = 10）。通過(guò)雙向方差分析和  Tukey  事后檢驗(yàn)，WT  和  Rescued  GSPT1-KO  U87  細(xì)胞之間沒(méi)有顯著差異。GSPT1-KO(A-7)  細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)作為參考。  C  實(shí)驗(yàn)圖表將  1  ×  106  GSPT1-KO  以及  Rescued  GSPT1-KO  U87  細(xì)胞移植到裸鼠腦內(nèi)。D  移植有  GSPT1-KO  或  Rescued  GSPT1-KO  U87  細(xì)胞的腦腫瘤在第  20  天取出、固定、嵌入石蠟中，并對(duì)  GSPT1  進(jìn)行免疫染色（n  =  5）。比例尺：100  μm。E  繪制了從移植到死亡的存活期（x  軸）和存活率（y  軸）。n  =  5；**P  =  0.0018，采用  Kaplan-Meier  方法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)。

3.檢測(cè)GSPT1-KO U87細(xì)胞與WT U87細(xì)胞相比的凋亡情況，以及GSPT1-KO U87細(xì)胞移植的腦腫瘤與WT和拯救GSPT1-KO U87細(xì)胞移植的腦腫瘤相比的凋亡情況。

GSPT1-KO U87細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。A、B、WT和GSPT1-KO U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在62.5-500 nM濃度的斯塔烏羅辛（staurosporine）作用下9小時(shí)。為了評(píng)估細(xì)胞凋亡，WT和GSPT1-KO U87細(xì)胞裂解液通過(guò)抗PARP1抗體進(jìn)行免疫印跡（A）。在每種斯塔烏羅辛濃度（250、375和500 nM）下，PARP1的裂解片段通過(guò)α-微管蛋白進(jìn)行歸一化并繪制（B）。C-F、將WT U87細(xì)胞或經(jīng)CC-885處理的WT U87細(xì)胞（C，第24天）以及WT、GSPT1-KO或恢復(fù)的GSPT1-KO U87細(xì)胞（E，第20天）移植到腦腫瘤中。將樣本從體內(nèi)取出，固定并包埋在石蠟中。使用抗cleaved caspase-3抗體進(jìn)行免疫染色。

4.患者腦膠質(zhì)瘤樣本中GSPT1的表達(dá)情況，以及表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

A-C 展示了3名患者腦膠質(zhì)瘤樣本的GSPT1蛋白表達(dá)情況。上層圖為釓增強(qiáng)的MR圖像。中間和下層圖展示了GSPT1免疫染色與蘇木精復(fù)染的顯微照片?；颊?為60歲男性，腫瘤位于右側(cè)額葉前部?；颊?為64歲男性，腫瘤位于左側(cè)額葉?；颊?為59歲男性，腫瘤位于右側(cè)頂葉。GSPT1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞漿中表達(dá)。值得注意的是，GSPT1在血管細(xì)胞中不表達(dá)。患者1和2的GSPT1表達(dá)較強(qiáng)；然而，患者3的GSPT1表達(dá)較弱至中等。每個(gè)顯微照片底部左方的數(shù)字代表GSPT1 mRNA在實(shí)時(shí)RT-PCR分析中的相對(duì)表達(dá)值。GSPT1免疫染色水平與相對(duì)mRNA表達(dá)值之間無(wú)相關(guān)性。上層圖尺度條為100微米（上層圖）和50微米（下層圖）。D 比較了GSPT1免疫染色水平與GSPT1 mRNA相對(duì)表達(dá)值之間的關(guān)系。Kaplan-Meier曲線(xiàn)顯示根據(jù)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中GSPT1的mRNA表達(dá)水平將患者分為兩組。將87例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者按照GSPT1表達(dá)值的中位數(shù)進(jìn)行分組。GSPT1high：GSPT1表達(dá)值高于中位數(shù)。GSPT1low：GSPT1表達(dá)值低于中位數(shù)。左側(cè)圖：神戶(hù)大學(xué)醫(yī)院的數(shù)據(jù)集。右側(cè)圖：TCGA膠質(zhì)母細(xì)胞瘤2013的數(shù)據(jù)集，可自由獲取。

結(jié)論

• CC-885處理的裸鼠相較于對(duì)照組有顯著更長(zhǎng)的生存期，表明GSPT1的降解能夠抑制腦腫瘤的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)生存期。

• GSPT1-KO U87細(xì)胞和Rescued GSPT1-KO U87細(xì)胞在裸鼠腦中的移植實(shí)驗(yàn)顯示，GSPT1的缺失能夠延長(zhǎng)生存期，而過(guò)表達(dá)GSPT1則沒(méi)有這種效果。

• GSPT1-KO U87細(xì)胞和GSPT1-KO U87細(xì)胞移植的腦腫瘤表現(xiàn)出增強(qiáng)的凋亡，說(shuō)明GSPT1的缺失或降解使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞更容易死亡。

• 盡管在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者樣本中檢測(cè)到GSPT1的表達(dá)，但GSPT1 mRNA水平與總體生存期之間沒(méi)有相關(guān)性，提示GSPT1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)至關(guān)重要，但可能與其惡性特征無(wú)關(guān)。

• 研究者們提出GSPT1是一個(gè)潛在的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療靶點(diǎn)，但其作為翻譯終止因子的功能可能帶來(lái)意外的副作用，因此需要進(jìn)一步研究以開(kāi)發(fā)出最小化非靶向效應(yīng)的新型藥物。

展望

基于GSPT1在腫瘤細(xì)胞中的重要作用以及近年來(lái)在藥物研發(fā)領(lǐng)域的快速進(jìn)展，GSPT1在腫瘤治療中的應(yīng)用前景十分廣闊。未來(lái)，隨著對(duì)GSPT1功能機(jī)制的深入研究以及新型靶向藥物的不斷涌現(xiàn)，GSPT1有望成為腫瘤治療領(lǐng)域的一個(gè)重要靶點(diǎn)，為癌癥患者帶來(lái)新的治療希望和選擇。

Starter相關(guān)產(chǎn)品推薦

驗(yàn)證數(shù)據(jù)

GSPT1蛋白：高活性，高純度驗(yàn)證

The GSPT1 activity was detected using HTRF technology. The reaction was performed by incubating the GSPT1 protein, CRBN and varying concentration of CC-885 and beads at 25℃ for 60 min,  then reading ratio 665/620 on BMG.

純度＞90%

GSPT1抗體:WB, IP, ICC等多重驗(yàn)證

E3泛素連接酶:DDB1/CRBN Complex

The CRBN/DDB1 activity was detected using HTRF technology. The reaction was performed by incubating the varying concentration of lenalidomide, CRBN/DDB1 protein, substrate and beads at 25℃ for 60 min, then reading ratio 665/620 with BMG.